ELISA試劑盒的操作方法【白介素elisa試劑盒】

發(fā)布時(shí)間：2021/6/3 8:34:28 閱讀次數(shù)：1062

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定enzyme linked immunosorbent assay（簡(jiǎn)寫(xiě)ELISA）,指將可溶性的抗原或抗體結(jié)合到聚苯乙烯等固相載體上,利用抗原抗體結(jié)合專(zhuān)一性進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測(cè)方法.要知道elisa操作步驟首先我們先了解一下elisa的原理是什么.

elisa的原理：

①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面,并保持其免疫活性.

②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體,這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性, 又保留酶的活性.在測(cè)定時(shí),把受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng).用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開(kāi),*后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例.加入酶反應(yīng)的底物后,底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物, 產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),故可根據(jù)焰色反應(yīng)的深淺刊物定性或定量分析.由于酶的催化效率很高,故可地放大反應(yīng)效果,從而使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度.

elisa操作步驟：

方法一　用于檢測(cè)未知抗原的雙抗體夾心法:

1.　包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg/ml.在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml,4℃過(guò)夜.次日,棄去孔內(nèi)溶液,用洗滌緩沖液洗3次,每次3分鐘.（簡(jiǎn)稱(chēng)洗滌,下同）.

2.　加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃孵育1小時(shí).然后洗滌.（同時(shí)做空白孔,陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔）.

3.　加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中,加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體（經(jīng)滴定后的稀釋度）0.1ml.37℃孵育0.5～1小時(shí),洗滌.

4.　加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml,37℃10～30分鐘.

5.　終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml.

6.　結(jié)果判定：可于白色背景上,直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深,陽(yáng)性程度越強(qiáng),陰性反應(yīng)為無(wú)色或淺,依據(jù)所呈顏色的深淺,以“+” “-”號(hào)表示.也可測(cè)O·D值：在ELISA檢測(cè)儀上,于450nm（若以ABTS顯色,則 410nm）處,以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔O·D值,若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍,即為陽(yáng)性.

方法二　用于檢測(cè)未知抗體的間接法：

用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg/ml,每孔加0.1ml,4℃過(guò)夜.次日洗滌3次.加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃孵育1小時(shí),洗滌.（同時(shí)做空白陰性及陽(yáng)性孔對(duì)照）于反應(yīng)孔中,加入新鮮稀釋的酶標(biāo)二抗體（抗抗體）0.1ml,37℃孵育30-60分鐘,洗滌,*后一遍用DDW洗滌.其余步驟同“雙抗體

以上是elisa操作步驟,那么在elisa操作步驟的操作步驟中需要注意什么呢？下面是elisa實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)：

1.正式試驗(yàn)時(shí),應(yīng)分別以陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照控制試驗(yàn)條件,待檢樣品應(yīng)作一式二份,以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性.有時(shí)本底較高,說(shuō)明有非特異性反應(yīng),可采用羊血清兔血清或BSA等封閉.

2.在elisa操作步驟中,進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件的選擇是很重要的,其中包括：固相載體的選擇包被抗體（或抗原）的選擇酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇酶的底物及供氫體的選擇

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