Western Blot 常見(jiàn)問(wèn)題分析（三）

發(fā)布時(shí)間：2020/6/2 15:41:05 閱讀次數(shù)：1756

前兩周的“Western Blot 常見(jiàn)問(wèn)題分析”中,我們主要分享了一些異常的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,今天我們來(lái)講講關(guān)于Western Blot實(shí)驗(yàn)可能會(huì)存在的疑惑.話不多說(shuō),直接上貨：

1．Western實(shí)驗(yàn)中,用TBS還是PBS？

選擇合適的緩沖液對(duì)于維持一定pH值下蛋白質(zhì)的穩(wěn)定及保證實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性很重要.PBS的緩沖能力強(qiáng)于TBS,TBS在pH7.0以下緩沖能力較弱.一般根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x用合適的緩沖液,如在蛋白純化中進(jìn)行陰離子交換層析,陽(yáng)離子緩沖液選TBS；陽(yáng)離子交換層析時(shí),陰離子緩沖液選PBS.Western blot中使用PBS和TBS均可,根據(jù)需要選擇合適的濃度.

2. 沒(méi)有注明可以用來(lái)做Western blot的一抗,可以用來(lái)做Western blot嗎？

不一定,因?yàn)橛械目贵w是識(shí)別線性表位的,有的是識(shí)別構(gòu)象型表位,識(shí)別構(gòu)象型表位的抗體不能用于Western blot,因?yàn)樵赪estern blot中抗體識(shí)別的是完全變性的蛋白質(zhì)抗原,而蛋白質(zhì)抗原的構(gòu)象型表位變性時(shí)被破壞.

3．做Western每次只加一種一抗,可以同時(shí)加兩種或者多種一抗嗎？

不要同時(shí)加兩種一抗,因?yàn)槿绻Y(jié)果里面有非特異性信號(hào)的話,就說(shuō)不清楚.做Western在同一張膜上檢測(cè)目的蛋白和內(nèi)對(duì)照,也是先上目的蛋白的一抗二抗 ECL顯色壓片洗片,漂洗后加內(nèi)對(duì)照的一抗二抗 ECL顯色壓片,洗片.

4. Western用的一抗,單抗好些還是多抗好些？

做Western來(lái)講,理論上單抗比多抗的特異性要好但價(jià)格偏高,一般來(lái)說(shuō)多抗就OK了.用于Western的抗體和用于ELISA的抗體,一般來(lái)說(shuō)用于Western的抗體識(shí)別的是氨基酸序列特異性,而可用于ELISA的抗體要看抗原種類,有些是識(shí)別氨基酸序列特異性,有些是識(shí)別構(gòu)象特異性,所以一般根據(jù)說(shuō)明書(shū)來(lái)確定.做免疫印跡選擇抗體主要考慮兩個(gè)問(wèn)題,一是所選抗體是否識(shí)別凝膠電泳后轉(zhuǎn)印至膜上的變性蛋白,另一個(gè)是所選抗體是否會(huì)引起交叉反應(yīng)條帶.

5. 半干轉(zhuǎn)是否要取膜濾紙膠同樣大小,因?yàn)槟z大小不一定規(guī)則,膜和濾紙會(huì)大一點(diǎn),那樣會(huì)不會(huì)短路？

可以相等,但是如果濾紙膜比凝膠大就比較容易形成短路了,上下兩層濾紙也不能因過(guò)大而相互接觸,這樣會(huì)短路,電流不會(huì)通過(guò)膠和濾紙.轉(zhuǎn)移前和轉(zhuǎn)移過(guò)程中看看電壓就行,正常的半干轉(zhuǎn)是慢慢變高的,結(jié)束時(shí)一般是開(kāi)始的1.5-3倍都是正常的.

6. 不能很好的將大分子量蛋白轉(zhuǎn)移到膜上,轉(zhuǎn)移效率低怎么解決？

大分子量蛋白傾向于在膠里沉淀,阻礙轉(zhuǎn)移.可以考慮：在轉(zhuǎn)膜緩沖液里加入終濃度0.1%的SDS有助于增加轉(zhuǎn)移效率；轉(zhuǎn)移緩沖液中加入20%甲醇,甲醇可以降低蛋白質(zhì)洗脫效率,增加蛋白質(zhì)和NC膜的結(jié)合能力,防止凝膠變形,延長(zhǎng)大分子量蛋白轉(zhuǎn)移時(shí)間；用4℃濕轉(zhuǎn)過(guò)夜代替半干法轉(zhuǎn)膜.